Neuroscience

IncuCyte研究分野

IncuCyte®神経細胞活性アッセイ

概要

神経変性疾患は、神経系を構成する細胞の構造と機能が徐々に失われていくことを特徴とする疾患です。
気づかないうちに徐々に変化して発病に至るため、原因を特定するのは難しく、そのような動的なプロセスを明らかにするには、細胞の生態をin vitroにおいて経時的に絶えずモニタリングする技術が必要となります。

ハイコンテントイメージングやタイムラプス顕微鏡観察といった他の技術とは異なり、全自動で画像を取得・解析するIncuCyte® S3生細胞解析システムは、細胞の小さな動的な変化を長期にわたって捉えることができます。インキュベーター内で細胞培養しながら、細胞の健康状態、構造、機能、神経突起破壊に関する動態学的測定値をin vitroにおいて収集することができるのです。ラベルフリーまたは細胞に影響を与えない試薬を使用するため、エンドポイント解析とは異なり、細胞の形態が破壊されたり制限されることがありません。そのため、個々の細胞からより多くのデータを収集することができるのです。

IncuCyte S3生細胞解析システム, 神経動態解析ソフトウェアIncuCyte専用試薬・各種キット を使用することで、生細胞を96-wellスループット/384-wellスループットで解析するための新しい包括的なソリューションが実現します。

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主なアプリケーションとそれぞれの利点

生細胞のイメージングと解析を行うための、神経変性疾患研究ツールを拡張できます。

神経変性と神経保護のメカニズムを明らかにするための、動的なデータが得られます。IncuCyte S3生細胞解析システムは下記を実現します:

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関連する神経変性モデルを活用

画像に基づく長期的かつ動的な測定値を用いて疾患モデルを探索できる。  

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神経突起破壊に関する手掛かりとなる動的データを取得

神経突起伸長とセルヘルスにおける動的な変化を定量化できる。 

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生産性の向上

マルチプレックスで長期間モニタリング。また、貴重な試薬を節約できる。

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特長 利点
・ 独自の可動式の光学縦列により、光学部が動いても細胞を安定した状態に保つことができる。

・ お手持ちの組織培養インキュベーターでインキュベーションが行える。
物理的に損傷しておらず生理学的に類似する状態にある感受性細胞を用いて長期的な(数週間または数ヵ月に及ぶ)実験を行うことができる。繊細な神経突起構造を傷つけない。
自動で画像を取得・解析するため、一度に最大6個のマイクロプレートを用いて96 wellフォーマットで動態学的測定値を得ることができる。 信頼性の高い薬理学的解析が実施可能。あるいはより短い時間でより多くの変数を調べることが可能。
専用のガイド付きの画像解析ワークフローで、高位相差画像において神経突起構造と分岐部位を測定できる。 ラベルフリーで神経突起伸長を定量化できる。 
独自の試薬により、細胞の健康状態や形態に影響を与えずに、神経突起を蛍光標識したり、セルヘルスを調べたりできる。 共培養で動的な神経突起伸長解析を行い、同時にマルチプレックス解析でセルヘルスに関するデータを獲得してさらなる理解に役立てられる。
固定、染色、抗体標識などを必要としない、シンプルで細胞を節約できるプロトコル。しかもバリデート済み。 貴重な試料を節約しながらより豊富な情報を含んだデータが得られる。
計測器・ソフトウェア・試薬・細胞キットを完全装備した包括的なソリューション トラブルの解消に費やす時間が減り、研究により多くの時間を使うことができる。

関連する神経変性モデルを活用

連続的な試料インキュベーションを行い、自動で長期的に動的な画像を取得・解析するため、パーキンソン病モデル、ハンチントン病モデル、アルツハイマー病モデル等の探索が可能。

Neuroscience Figure 1

図1.ヒトの神経変性疾患をより正確に再現している生理学的に類似するin vitroモデルを用いて、貴重な生物学的手掛かりを得ることができる

。蛍光NeuroTrack画像と、Dopa.4U細胞パーキンソン病モデルを用いた6-OHDA媒介毒性の定量化(Ncardia)。Dopa.4U細胞をIncuCyte NeuroLight Red試薬で感染させ、20倍対物レンズを用いて12日間にわたって6時間ごとに画像化。6-OHDAにより神経突起長は時間・濃度依存的に減少し、IC50濃度は84 µMであった。


神経突起破壊に関する手掛かりとなる動的データを取得

単培養または共培養で神経突起伸長とセルヘルスを観察し、ニューラルネットワークにおける動的な変化をモニタリング。神経毒性と細胞死に関する手掛かりを得て、神経変性と神経保護の研究に役立てる。

Neuroscience Figure 2

図2.IncuCyte Neurotrackソフトウェアを使用して、長期にわたって非標識で神経突起長の動的な測定値を得ることで、神経変性と神経保護の過程で薬剤によって生じた構造的柔軟性の差が明らかに。

iCell Neurons(CDI)にカイニン酸(KA)を単独添加あるいはカイニン酸(KA)をCNQX(AMPA受容体アンタゴニスト)または増殖因子BDNFとともに添加したときの神経突起長の経時的な動的変化(左の図)。CNQXはカイニン酸により誘発される神経毒性を完全に阻害するが、BDNFを添加すると神経突起は後のタイムポイントにおいて回復した。予想に反して、KAを添加した場合にはH1152の神経保護作用は認められず、後のタイムポイントにおいて神経突起の消失が増加した。神経突起伸長モジュレーターの神経保護率(%)を後期と初期のタイムポイントの間で比較(右の図)。

Neuroscience Figure 3a

Neuroscience Figure 3b

Neuroscience Figure 3c

Neuroscience Figure 3d

図3.生理学的に類似するヒトiPSC由来ニューロンモデルでのセルヘルス測定値を用いた神経突起伸長のマルチプレックス解析。

(上の図)ラットアストロサイトと共培養したときのラット前脳ニューロンの代表的なタイムラプス動画。細胞をIncuCyte NeuroLight Red試薬に感染させ、IncuCyte Annexin V Green試薬とともにインキュベートして、神経突起長とアポトーシスをそれぞれモニタリングした。溶媒(左)または1mMカイニン酸(右)を添加後72時間にわたって動画を撮影。

(下の図)ラットアストロサイトとの共培養でiCell GlutaNeuronsにカイニン酸を添加したときの神経突起長(A)と細胞生存率(B)への作用の経時的変化カイニン酸により神経突起長は濃度依存的に減少し、細胞生存率は低下した(IncuCyte Annexin V Greenの染色は増加)。NBQX(AMPA受容体アンタゴニスト)を添加すると、iCell GlutaNeuronsに興奮毒性に対する保護作用が認められた。

Neuroscience Figure 4

図4.神経変性研究用として実証されているデータのモニタリングを目的とした、初代ニューロン培養での神経突起伸長とセルヘルス測定値のマルチプレックス解析。

ラットアストロサイトとの共培養で初代ラット前脳ニューロンに培養8日目にグルタミン酸を添加したときの神経突起長(左の図)と細胞生存率(中央の図)に対する作用の経時的変化。グルタミン酸の添加により神経突起長は濃度依存的に減少し、細胞生存率は低下した(IncuCyte Annexin V Greenの染色は増加)。グルタミン酸濃度の説明文はいずれのデータについても同じ。   グルタミン酸へのピーク反応の時点で実施した単一タイムポイント解析(右の図)。神経突起長(添加の24時間後)のIC50=16 µM、アポトーシス細胞死(添加の8時間後)のEC50=21 µM(Annexin V Green)。


生産性の向上

マルチプレックスとスループットの向上で貴重な試料を節約。細胞の小さな動的変化を捉えるため、長期にわたって自動イメージング解析を実施。マイクロプレートスループットでさまざまな実験条件について検討し、創薬研究に活用。

Neuroscience Figure 5

図5.任意の初代細胞またはiPSC由来ニューロン細胞種での神経変性疾患データの検討。

最小数の細胞を6×96 wellプレートまたは6×384 wellプレートに同時に播種し、連続自動画像取得により、一貫性のある大量のデータセットを迅速に作成。IncuCyte NeuroLight Red試薬は、さまざまな実験用細胞モデルでの神経突起長のモニタリングに使用することができる(上の図)。iCell Neuronの神経突起長の経時的変化から、384 wellプレートで11日間培養するというプロトコルは再現性が高いことが実証された – CV<15%(左下の図と挿入図)。薬理作用の再現性を示す384 wellプレートと、容易に作成することができたEC/IC50曲線(右下の図と挿入図)。


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