アプリケーション

スクラッチアッセイ

概要

細胞遊走とは、胚発生、組織再構築、血管新生、免疫細胞輸送、慢性炎症、創傷治癒、腫瘍転移といった数多くの生物学的・病理学的過程の基本要素である、多段階のプロセスです。

細胞遊走の第一段階では、刺激が加わることにより、細胞の極性化や、迅速なアクチンフィラメントおよび微小管の再構築をもたらす、一連のシグナル伝達経路が活性化されます。細胞は、リーダー細胞の境界部に存在する細胞膜を突出させて前進します。そして、インテグリンが基質に接着することで、基質との動的接着が起こります。この周期は、フォロワー細胞の端にある細胞膜の陥凹によって終了し、次々に繰り返されます。このプロセスが積み重ねられて、細胞遊走が起こります。

細胞浸潤は、がんの特徴の1つです。細胞遊走と関連しており、転移において重要な役割を果たします。この転移こそが、がん患者の主な死因となっています。がん細胞が転移性腫瘍を形成できるのは、がん細胞が形態を変化させて再構築し、細胞外基質(ECM)を分解するという能力を備えているからです。がん細胞浸潤に関与するメカニズムが解明されれば、がんの進行を制限し、多くのがん患者の死亡率を低下させられる可能性があります。

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アッセイ詳細

IncuCyte®スクラッチアッセイ

一度に最大6個の96wellプレートを用いるスクラッチアッセイ(ラベルフリーおよび蛍光ラベル)で、リアルタイムな細胞形態の可視化・解析を可能にする総合的なソリューション。しかも、あなたのインキュベータ内で。

IncuCyteスクラッチアッセイで、下記を実現します:

  • 投与が遊走の全時間的経過を通してプロファイルに及ぼす作用を観察
  • 転移能を調べ、投与が浸潤型に及ぼす作用を明らかに
  • 同一プレート内で、細胞遊走と細胞浸潤の生物学的特徴の違いを探索

Visual validation of treatments and conditions in IncuCyte® Scratch Wound Migration and Invasion Assays

IncuCyte™スクラッチアッセイによる投与と条件の視覚的バリデーション+B13:遊走細胞と浸潤細胞との間で、HT-1080細胞の形態と創傷閉鎖速度に差が認められた。また、遊走速度は浸潤速度を上回ることが判明。3種類の細胞はすべて、I型コラーゲンをコーティングしたwell上で遊走。高浸潤性のHT-1080細胞とMDA-MD-231細胞は、3Dコラーゲンゲルに浸潤(1、2、3 mg/mL)。一方、比較的非浸潤性のMCF-7細胞は、本アッセイの条件下で、3Dコラーゲンゲルに浸潤しなかった。


従来の手法とIncuCyte®スクラッチアッセイを比較

従来のスクラッチアッセイ IncuCyte® スクラッチアッセイ
走化性勾配の非存在下で遊走
細胞使用量が少ない(5,000個未満/well)
非接着性細胞に適している
表面上で遊走
3Dゲルマトリックスに浸潤
総合的に定量化できる
総合的に細胞観察ができる
高精度で再現性が高い
96well以上に対応するスループット
動態学的な観察結果
ラベルフリー
アッセイ中に離席OKか

特徴

IncuCyte® スクラッチアッセイの特徴

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細胞遊走・浸潤を可視化。生物学的変化をリアルタイムに観察

  • 3Dバイオマトリックスゲル(例:Matrigel™)への細胞浸潤をリアルタイムにイメージング、定量化
  • 位相画像により、あらゆるタイムポイントにおける細胞形態の評価が可能
  • グラフィカルな描写で、初期の創傷と、各タイムポイントにおける経時的な創傷閉鎖を明確に可視化

Quantifying cell migration and invasion with the scratch wound method

スクラッチ法で細胞遊走と細胞浸潤を定量化。緑色領域は、HT-1080細胞が創傷領域へと遊走する際の経時的な(t=0時間、t=2時間)スクラッチマスクを示す。創傷形成直後に形成される初期のスクラッチマスクを青色で表しています。t=6時間で完全な創傷閉鎖を確認。


オリジナルWoundMakerツールを併用し、標識細胞を用いずに再現性の高い定量測定を簡単に実現

WoundMaker™ツールは、96個のピンが配置された器具です。ボタンを押すと、プレートごとに均一なスクラッチがほんの数秒で形成されます。独自に設計された先端で、細胞を損傷することなく、無菌の均一な創傷を形成し、コンフルエントな細胞単層から細胞フリーゾーンを作り出しますので、一貫性のある生物学的特徴を再現することができます。これは本スクラッチアッセイの最大の強みです。

HT-1080 monolayer scratch comparison using a Corning® 96-well plate

動画: WoundMaker操作説明
WoundMaker™ツールは、96個のピンが配置された器具です。ボタンを押すだけで、数秒で均一なスクラッチを形成します。

HT-1080 monolayer scratch comparison using a Corning® 96-well plate

HT-1080細胞単層スクラッチ―Corning®96wellプレートとの比較:10 µLピペットの先端を用いて手動で形成したスクラッチには、well間で、スクラッチの幅や位置の均一性が異なっていることがわかります(上)。WoundMaker™ツールは、ボタンを押すだけで、すべての96well内に均一なスクラッチを形成します(下)。どれだけ時間を節約できるかご想像ください。

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IncuCyte® ImageLock Plate Product Note


2D遊走と3D浸潤を同時に直接比較

  • 静止画とタイムラプス動画で、細胞遊走と浸潤プロファイルを比較し、細胞の形態変化を詳細に解析
  • ペアワイズ解析で、薬物の特異性や薬剤標的候補の有用性が明らかに

Investigate migration & invasion behavior in mixed cultures

混合培養における遊走および浸潤の挙動の検討:位相差像に加えて、2色蛍光スクラッチのイメージングも可能になったため、細胞遊走や細胞浸潤に関連する細胞間相互作用を探索することができます。HT-1080細胞は創傷領域に浸潤していますが、MCF-7細胞は浸潤していないことがわかります。

Pharmacological comparison of blebbistatin and GM6001 effect on the invasive phenotype of HT-1080 cells in Collagen I and Matrigel matrix

ブレビスタチンおよびGM6001がI型コラーゲンおよびMatrigel®マトリックス中の浸潤型HT-1080細胞に及ぼす薬理学的作用の比較:このデータから、ブレビスタチンは、I型コラーゲンおよびMatrigel®マトリックスを介する浸潤のいずれも阻害し(左)、一方、GM6001は、I型コラーゲンを介する浸潤は阻害するが、Matrigel®マトリックスを介する浸潤は阻害しないことがわかります(右)。

Download scratch wound cell migration and invasion detailed protocols

scratch wound cell migration quick guide

スクラッチアッセイクイックガイド

scratch wound cell invasion quick guide

スクラッチアッセイ細胞浸潤クイックガイド

あらゆる非接着細胞、腫瘍細胞に対応

IncuCyteスクラッチアッセイは、HUVEC細胞株やがん細胞株をはじめとする、30種類を超える初代細胞および不死化細胞でバリデーションが行われています。

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FAQ

スクラッチアッセイFAQ

Scratch-wound migration and invasion assays require loosely adherent cells that preferentially form monolayers. Cells that form strong adhesion to either the cell culture substrate or one another may form inadequate scratch wounds (incomplete removal of cells and cell debris from the length and width of the wound), inhomogeneous scratch wounds (different lengths, widths, and paths), or the cell monolayer may peel from the substrate during the scratch-wounding procedure. We recommend confirming the adhesion properties of your cells of choice on your substrate of choice by running a pilot experiment before choosing a cell type or cell line for use in a scratch-wound migration or invasion assay.

For details about forming reproducible scratch wounds across 24- and 96-well plates, check out the WoundMaker™.

Scratch-wound healing, or repair, is a common cell migration assay, measuring the speed and efficiency with which cells in a monolayer migrate to close a gap in the monolayer (a scratch wound). The length of time it takes to achieve scratch-wound repair is directly related to the cells, their ability to migrate on the substrate, and the width of the scratch wound. Depending on these factors, a scratch-wound assay may take anywhere from 4 hours to 24 hours, or longer. Since the assay requires frequent monitoring to assess progress – acquiring an image of each well’s repair progress every hour – an automated live-cell analysis system allowsyou to set up your scratch-wound assay, determine the imaging intervals, and walk away.

The scratch-wound migration assay is based on the formation of a scratch wound across a monolayer of cells and the assessment of how long it takes for the scratch wound to “heal”. Scratch wounds heal when cells on either side of the wound migrate into the empty space. This is a direct measure of cell migration along the surface of a solid, 2-D substrate. Cell-invasion assays are based on the scratch-wound approach, but include the addition of a gel matrix applied on top of the scratch wound. The scratch wound then heals, but it does so by the invasion of cells into and through the semisolid matrix. Some common matrices used for cell invasion assays include Collagen I and Matrigel®. The addition of the 3-D gel matrix requires the cells to penetrate and navigate (rather than simply migrating), which is not an ability shared by all cell types, but is common among tumor cell lines. In vitro-invasion assays, like the Matrigel® invasion assay, can closely recapitulate the biology of tumor cell invasion, in a plate-based format.

Scratch wounds are commonly generated with pins or cell scrapers, but these tools can lead to unreliable or inadequate scratch wounds. Variability in scratch wounds can make meaningful analysis difficult, as wound length and depth may be vastly different across a single plate.

The WoundMaker™ is specially designed to generate consistent results without damaging or deforming the plastic surface or ECM coating at the bottom of the well. The WoundMaker’s soft PTFE tips produce scratch wounds of a reliable width, without marring the cells’ paths. Scratched or dimpled plastic or ECM may impact the ability of migrating cells to cross the scratch wound, leading to anything from extended migration times to arrested migration. For optimal data quality and reproducibility, the WoundMaker™ is the best choice for safely creating scratch wounds in cell monolayers.

For more details on improving the reliability of your scratch-wound assays, check out our cell migration assay protocols at the bottom of this page.

Standard scratch wound and in vitro-invasion assays are typically set up in a tissue culture hood, moved to an environmentally controlled incubator, and removed to normoxic conditions and room temperature at regular intervals for microscopy. While most researchers are conscientious about keeping this excursion from incubation conditions as brief as possible, the actual time can stretch from 5 to 15 minutes, or longer. The change in atmospheric and thermostatic conditions can rapidly affect the cells’ growth and behavior,1-3 particularly when grown in small volumes, as is the case in 96well plates; smaller volumes of liquid are quicker to equilibrate to room temperature than larger volumes. Ensuring proper image registration between imaging series can be difficult when the plates are transported from the incubator to the microscope, and back again. Alternatively, experiments may be performed on microscopes with on-stage environmental enclosures. If leaks are encountered, then the environmental stability may be compromised and adversely affect cell health and motility. When you move your entire imaging apparatus into the incubator, as is now possible with the IncuCyte™ System, you’re able to image your cells actively behaving as they do under normal growth, migration, and invasion conditions. This means you’re more likely to capture accurate and meaningful data, from a morphological, physiological, and physico-chemical point of view. By keeping cells under optimal conditions throughout the assay, the cells are free to behave, without intrusion or interruption, yielding clearer, more meaningful data.

  1. Vergara, M., Becerra, S., Berrios, J., Osses, N., Reyes, J., Rodriguez, M., et al. Differential Effect of Culture Temperature and Specific Growth Rate on CHO Cell Behavior in Chemostat Culture. PLoS One. 9(4):e93865 (2014)
  2. Rezaei, M., Zarkesh-Esfahani, S.H., and Gharagozloo, M. The effect of different media composition and temperatures on the production of recombinant human growth hormone by CHO cells. Res. Pharm. Sci. 8(3):211-7 (2013)
  3. Mason, M., Sweeny, B., Cain, K., Stephens, P., and Sharfstein, S.T. Reduced Culture Temperature Differntially Affects Expression and Biophysical Properties of Monoclonal Antibody Variants. Antibodies. 3:253-71 (2014)

At first glance, that does seem like a tall order – tracking individual cells throughout the entirety of a cell-migration assay – but it doesn’t have to be a day-long ordeal, dashing between the incubator and the microscope! In-incubator, live-cell analysis platforms, like the Essen IncuCyte™, can keep track of cell count, cell morphology, and cell migration, all while the cells remain in temperature- and atmosphere-controlled conditions. Live-cell analysis makes is possible to confirm the relative wound density of your scratch wound, the only direct measure of cell migration vs. cell proliferation in scratch-wound healing.

For additional details on the workflow and hands-on time, refer to the assay protocols (for scratch wound migration and scratch wound invasion) at the bottom of this page.

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